Patomorfolodzy i genetycy molekularni: niewidzialni bohaterowie współczesnej walki z nowotworami

W świecie, w którym onkologia obiecuje terapie celowane, immunoterapię i medycynę precyzyjną, chorzy na nowotwory wciąż zbyt często są leczeni na ślepo. Klucz do tej układanki leży bowiem nie w rękach lekarza przy łóżku chorego, lecz w odizolowanych pracowniach i laboratoriach, gdzie nad kawałkami tkanki, mikroskopem lub sekwenatorem do analizy genetycznej pochylają się patomorfolodzy i genetycy molekularni – niewidzialni bohaterowie współczesnej walki z nowotworami. Pacjenci na co dzień nie mają okazji ich spotkać. Zresztą nie widzą ich również dzieci z chorobami rzadkimi, osoby po transplantacjach, ze schorzeniami nerek ani większość operowanych, którym cokolwiek wycięto z ciała i przekazano do tzw. badania histopatologicznego. A każde z nich zawdzięcza tym ekspertom naprawdę sporo: od szczegółowego rozpoznania choroby po dobór najlepszego organu do przeszczepienia lub diagnozę mającą wpływ na resztę życia. „Bez hist-patu nie ma tematu” – powiadają żartobliwie patolodzy i genetycy, którzy stali się filarem diagnostyki we współczesnej medycynie.

Detektyw przy mikroskopie

Patomorfologia – dawniej anatomia patologiczna – jest działem medycyny zajmującym się rozpoznawaniem chorób na podstawie zmian morfologicznych w tkankach i narządach. Narodziła się z bardzo starego medycznego marzenia: żeby zajrzeć do wnętrza ludzkiego ciała i dotrzeć do sedna choroby. Pierwszy cel osiągnięto za sprawą sekcji zwłok, drugi długo czekał na rozwiązanie. Dopiero w XIX w. Rudolf Virchow (1821–1902), niemiecki lekarz uznawany za ojca nowoczesnej patologii, sformułował rewolucyjną jak na swoje czasy tezę, że źródeł wszelkich zaburzeń należy szukać w komórkach. Wcześniej medycyna operowała głównie objawami. Virchow zaproponował coś radykalnego: chorobę trzeba oglądać pod mikroskopem. Uczynił z tych narzędzi, znanych już od niemal 200 lat, nie byle co – najważniejszy oręż każdego naukowca w obszarze szeroko rozumianej biologii (co w dużej mierze zawdzięczano w owych czasach znacznym ulepszeniom mikroskopów, pozwalającym oglądać tkanki, jak mawiał sam mistrz, „300 razy bliżej”).

„Dziś fragmenty tkanek pobranych od pacjentów – podczas biopsji lub operacji – nadal trafiają pod mikroskopy w naszych pracowniach” – mówi prof. Agnieszka Perkowska-Ptasińska z Katedry i Zakładu Patomorfologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego (WUM). Oczywiście Virchow pracował na sprzęcie wystarczającym do bardzo podstawowej oceny tkanek, bez udogodnień i technik poprawiających widoczność szczegółów. Obecna mikroskopia świetlna, wykorzystywana w pracowniach patomorfologii, nadal opiera się na świetle widzialnym, ale pozwala zobaczyć ponad 1000 razy więcej. „Oglądając fragment tkanki, szukamy odpowiedzi na podstawowe pytania: co to jest, czy to nowotwór, jaki typ” – wylicza prof. Perkowska-Ptasińska. Na tym etapie można powiedzieć, czy zmiana ma charakter złośliwy, czy łagodny, ale chcąc określić konkretny typ nowotworu i jego pochodzenie (jeśli to np. rak płuca – czy powstał w nim, czy jest przerzutem?), trzeba wykonać tzw. badania immunohistochemiczne, które zidentyfikują rodzaj komórki rakowej oraz obecne na jej powierzchni markery. „Właśnie dlatego od naszej diagnozy zależy leczenie pacjenta. Cechy, które udaje się dzisiaj wykryć w komórkach, determinują rodzaj terapii” – wyjaśnia ekspertka.

To trochę tak jak w nowoczesnym lotnictwie pasażerskim – pilot siedzi w kokpicie, podejmuje decyzje i ponosi odpowiedzialność za pasażerów, ale coraz więcej kluczowych parametrów ustalają systemy ukryte pod pokładem lub w centrach kontroli lotów. Pacjent widzi zwykle ciąg dziejących się wokół niego zdarzeń: tomografię, biopsję, rozmowę i analizę wyników przez lekarza prowadzącego. Ma poczucie, że gabinet onkologa lub sala operacyjna są miejscami, gdzie zapadają wyroki i plany ratunku. Tymczasem jak w podróży na wysokości 11 tys. m o wszystkim zadecydowało oko i doświadczenie ludzi znajdujących się o wiele dalej, którzy wykonali swoją pracę przy mikroskopie, wśród skrawków zatopionych i utrwalonych w parafinie tkanek, barwień immunohistochemicznych i sekwencji DNA analizowanych przez algorytmy. Bo nawet sama patomorfologia nie pozwoli ustalić wszystkich faktów, niezbędnych przed rozpoczęciem leczenia. „W komórkach nowotworowych jest mnóstwo informacji genetycznych, dlatego przekazujemy wycinki guza do pracowni genetycznych. Tam są weryfikowane i na podstawie tych informacji będzie można lepiej dopasować terapię do potrzeb konkretnego pacjenta” – tłumaczy prof. Perkowska-Ptasińska.

Przez dekady patomorfolog był przede wszystkim „tym od histopatologii” – oceniał preparaty barwione hematoksyliną i eozyną, rozpoznawał typ nowotworu, stopień złośliwości i zaawansowanie. Dziś to za mało. Nowotwory nie są już „rakiem jelita” albo „rakiem płuca”. Są setkami podtypów z różnymi drogami molekularnymi. Dziś trzeba wiedzieć, jaką mutację ma guz u konkretnego pacjenta, bo od tego zależy reakcja organizmu na inhibitor kinaz, immunoterapię, a może tylko na standardową chemię.

Od wycinka do sekwenatora

„Diagnostyka molekularna jest naturalnym przedłużeniem współczesnej patomorfologii” – wątpliwości nie ma również prof. Tomasz Stokłosa z Laboratorium Genetyki Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego WUM. I uszczegóławia: „Patolog ocenia architekturę tkanki, my zaglądamy do kodu źródłowego komórek. Razem tworzymy duet, bez którego nie będzie precyzyjnej medycyny, a zwłaszcza onkologii. I nie rozróżniałbym, kto w tej parze jest ważniejszy. Musimy współpracować”. W praktyce onkolog pobiera wycinek, patomorfolog go ocenia, utrwala, preparuje, by móc obejrzeć pod mikroskopem. Genetyk nie dostanie „czystego” materiału bez precyzyjnej selekcji patologicznej. Większość pacjentów z zaawansowanym rakiem płuca, piersi lub jelita grubego powinna mieć te badania wykonane – inaczej terapia będzie strzałem w ciemno. Dlatego nowoczesne leki onkologiczne nazywa się dziś ukierunkowanymi molekularnie – sprawdzają się tylko u wyselekcjonowanych chorych z wykrytymi w badaniach genetycznych mutacjami, które stymulują procesy nowotworowe. Jeśli w raku płuca występuje np. mutacja w genie EGFR, wiadomo już, że zamiast tradycyjnej chemioterapii warto podać leki z grupy inhibitorów kinazy tyrozynowej, blokujące od środka receptor EGFR i szlak sygnałów stymulujących komórkę do niekontrolowanego podziału. A w przypadku zaburzenia genu ALK również można zastosować leki efektywne tylko w tej jednej konkretnej odmianie raka. Takich użytecznych markerów jest już kilkadziesiąt w różnych typach i lokalizacjach. Każda z nich oznacza inną prognozę i inny wybór kuracji.

To biologia molekularna i genetyka doprowadziły do tego, że coraz więcej leków w onkologii rejestrowanych jest dziś nie na podstawie lokalizacji guzów, lecz mutacji, które bywają podobne w nowotworach piersi, płuca, jelita lub w czerniaku. Najlepszy przykład to trastuzumab (szerzej znany pod nazwą handlową Herceptyna), zastosowany po raz pierwszy na przełomie XX i XXI w. u kobiet z rakiem piersi ze zwiększoną liczbą kopii zmutowanego genu HER2. Obecnie ten sam lek podawany jest również chorym na raka płuca lub żołądka, jeśli tylko wykryto w nich zmiany w identycznym genie. Zatrzymajmy się przez moment przy tym przykładzie. Receptory HER2 w raku piersi opisano jako ważny marker biologiczny już w latach 80. XX w. – nazwano je ludzkim naskórkowym czynnikiem wzrostu (z ang. human epidermal growth factor, stąd przyjął się skrót HER). Białko to, obecne na powierzchni komórek, przekazuje im bezwzględny sygnał do nieustannych podziałów. Kiedy gen odpowiedzialny za produkcję HER2 ulega zwielokrotnieniu, nowotwór staje się niezwykle agresywny – dotyczy to ok. 20% chorych na raka piersi. Odkrycie to doprowadziło do stworzenia trastuzumabu, przeciwciała blokującego ten receptor niczym klucz zatrzaśnięty w zamku. Nazwany Herceptyną, wszedł do użycia klinicznego w USA w 1998 r., a w Unii Europejskiej – w 2000 r. Dla pacjentek z nadekspresją HER2 był to przełom; dla pozostałych 80% – lek całkowicie bezużyteczny, generujący jedynie toksyczność i gigantyczne koszty publiczne.

W ten sposób narodził się paradygmat onkologii precyzyjnej, a badanie genomu komórek rakowych stało się w wielu wypadkach obowiązkiem już na samym początku ścieżki leczenia. Jak pisze dr hab. Paula Dobosz w książce „Nowoczesna diagnostyka w onkologii”, której jest współautorką i redaktorem naukowym: „Skuteczne leczenie nowotworu to w pierwszej kolejności dokładne poznanie wroga – namierzenie go tak wcześnie, jak to tylko możliwe, a następnie precyzyjne zidentyfikowanie patogennych wariantów genetycznych. Tylko wtedy zastosowane leczenie, idealnie dobrane dla każdego pacjenta i jego nowotworu, będzie naprawdę skuteczne”.

W Polsce jest już wystarczająca liczba laboratoriów oferujących tego rodzaju badania, ale nie zawsze są one dostatecznie finansowane, co niestety przekłada się na ich niepełne wdrożenie do praktyki. Gorzej z wykwalifikowanym personelem – patologów mamy w Polsce ok. 250, genetyków – ok. 200, więc mniej niż szpitali. Czy każdemu pacjentowi z nowotworem należy już na samym początku zlecać badanie genetyczne? Opinie są różne wśród onkologów i diagnostów. Prof. Stokłosa precyzuje, że powinno się to robić bezwzględnie wtedy, kiedy złośliwy nowotwór jest zaawansowany, przerzutowy, oporny na standardowe terapie, rzadki albo ma niepewną diagnozę patomorfologiczną (bo i tak się zdarza), o nieznanym punkcie wyjścia pierwotnej zmiany.

Kto decyduje o leczeniu

Diagnostyka molekularna nie działa więc w próżni. Między patomorfologiem a genetykiem istnieje głęboka symbiotyczna zależność, której ignorowanie prowadzi do diagnostycznych katastrof. Genetyk potrzebuje patomorfologa, aby ten najpierw ocenił materiał tkankowy pod mikroskopem, precyzyjnie zakreślił na szkiełku obszar bogaty w komórki nowotworowe i oddzielił go od zdrowego podścieliska lub obszarów martwicy. Jeśli do zaawansowanej aparatury włoży się zmielony fragment zdrowej tkanki łącznej z minimalną domieszką guza, urządzenie może się pomylić – wygeneruje piękny, uspokajający i całkowicie fałszywy wynik, opisujący idealny profil genetyczny pacjenta, podczas gdy ukryty w jego ciele nowotwór będzie nadal mutował. Biologia molekularna jest więc okiem, które widzi pojedyncze nukleotydy, ale to patomorfologia dostarcza mu lupy, by wiedziało, na który fragment nici DNA ma patrzeć.

Wróćmy do gabinetu onkologicznego. Wedle naszych ekspertów podawanie drogich i toksycznych leków najnowszej generacji bez precyzyjnej selekcji molekularnej to nie tylko marnowanie pieniędzy, ale też karmienie pacjentów fałszywą nadzieją. Dobrym przykładem są mutacje w rodzinie genów RAS (np. KRAS) w raku jelita grubego. Jeśli w tym genie występuje mutacja, nowotwór – używając obrazowego języka prof. Stokłosy – ma głęboko w nosie fakt, że onkolog poda drogie przeciwciało, mające zablokować receptor na powierzchni komórki (tzw. przeciwciało anty-EGFR). Dlaczego? Ponieważ zmutowany KRAS działa jak przełącznik zablokowany w pozycji „włączone” i nawet po wyłączeniu receptora EGFR komórka nadal otrzymuje sygnał do podziałów (a więc dalszego wzrostu guza). Sygnał ten płynie nieprzerwanie od wewnątrz niezależnie od tego, jak szczelnie lekarz zamknie zewnętrzne drzwi receptora EGFR. Podanie takiego leku pacjentowi z mutacją KRAS nie pomoże, a jedynie narazi go na efekty uboczne i ukradnie 3 mies. życia, po których badanie obrazowe wykaże bezlitosną progresję. Na początku czerwca o KRAS zrobiło się znowu głośno, ponieważ na dorocznym światowym kongresie onkologicznym ASCO (American Society of Clinical Oncology) poinformowano o świetnych wynikach nowego leku zastosowanego przy raku trzustki, który po wielu latach niemocy w tym bardzo trudnym nowotworze podwoił czas przeżycia z 6 do 13 mies. Chodzi o daraxonrasib – cząsteczka ta, po doustnym zastosowaniu, wyłącza KRAS w komórkach raka trzustki, a po stłumieniu sygnałów tego białka wzrost guza ulega spowolnieniu.

Dopiero gdy patomorfolog i genetyk wspólnie wyselekcjonują pacjentów pozbawionych tych negatywnych czynników predykcyjnych lub posiadających konkretne pożądane uszkodzenia genetyczne, wszystko idzie zgodnie z planem. Mediany przeżycia chorych z zaawansowanymi przerzutowymi nowotworami przestają być liczone w tygodniach, a zaczynają w miesiącach, a nawet długich latach względnie komfortowego funkcjonowania. W tym kontekście tradycyjny podział ról medycznych ulega całkowitemu rozmyciu. Onkolog staje się egzekutorem biologicznej prawdy, którą z kawałka ludzkiej tkanki wydarli specjaliści od mikroskopów i kwasów nukleinowych. Dla pacjenta proces ten jest całkowitą abstrakcją. Człowiek przechodzi nieprzyjemne badanie – biopsję podczas bronchoskopii, w trakcie której pneumonolog pobiera z płuca milimetrowy fragment guza – albo skomplikowaną operację chirurgiczną, a potem wraca do domu i czeka. Na wynik badania mikroskopowego – kilka dni, na wynik immunohistochemii – kolejnych kilka dni, wreszcie na badanie genetyczne – w idealnym świecie 2–3 tyg. „Nie da się tych terminów przyspieszyć” – informuje prof. Agnieszka Perkowska-Ptasińska. Tkanka trafia w tryby laboratoryjnej machiny, która przypomina skrzyżowanie XIX-wiecznego warsztatu rzemieślniczego z futurystyczną fabryką mikroprocesorów.

Najpierw pobrany materiał utrwala się w formalinie. Błędy na tym etapie – zbyt krótki lub zbyt długi czas trzymania w płynie utrwalającym – niszczą strukturę białek i prowadzą do fragmentacji kwasów nukleinowych, co sprawia, że dalsze badania będą przypominały próbę odczytania spalonej książki. Następnie odwodniona tkanka jest zalewana płynną parafiną i powstaje mała twarda kostka. Taki parafinowy bloczek to archiwum biologiczne pacjenta, które może być przechowywane przez dekady. Laborant za pomocą mikrotomu (precyzyjnej gilotyny z diamentowym lub stalowym ostrzem) odcina z tego bloczka warstwy o grubości zaledwie 3–4 µm i przenosi je na szkiełka.

Następnie zaczyna się wielopoziomowe barwienie. Poza klasyczną procedurą barwienia hematoksyliną i eozyną, co pozwala ocenić ogólny kształt komórek, patomorfolodzy stosują wspomnianą wcześniej immunohistochemię. Wykorzystują w niej specjalne wyznakowane przeciwciała, które łączą się tylko z konkretnymi białkami w badanej komórce. Pod mikroskopem patomorfolog szuka brązowego zabarwienia; jego obecność oznacza, że białko działa, a genom jest stabilny. Jeśli jednak komórki nowotworowe wykazują utratę tych białek, mamy do czynienia z tzw. niestabilnością mikrosatelitarną. To również wskazówka do wybrania najlepszej kuracji – taki guz, choć potwornie zmutowany, staje się idealnym celem nowoczesnej immunoterapii, ponieważ jego chaotyczne białka łatwo rzucają się w oczy pobudzonemu układowi odpornościowemu pacjenta.

Kiedy mikroskopia immunohistochemiczna wyczerpie swoje możliwości, bloczek wędruje do pracowni genetycznej. Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS, z ang. next-generation sequencing) pozwala jednocześnie odczytać bardzo dużą liczbę fragmentów DNA lub RNA z próbki. Np. zamiast testu na pojedynczą mutację w genie BRCA w raku piersi laboratorium może wykonać panel NGS, obejmujący kilkadziesiąt genów związanych z tym nowotworem, i wykryć różne typy wariantów jednocześnie. W rutynowej diagnostyce stosuje się również szybkie panele oparte na technologii qPCR. „W sprawnie działającym ośrodku maszyny sekwencjonują dziś 3 mld par zasad DNA w ciągu kilkunastu godzin. Dawniej robiły to przez 5 dni” – porównuje prof. Stokłosa.

Paradoksy i zakładnicy systemu

O ile polscy patomorfolodzy i genetycy dysponują wiedzą i sprzętem na światowym poziomie, o tyle administracyjno-finansowe warunki nie ułatwiają im pracy, co w oczywisty sposób odbija się na pacjentach oczekujących na wyniki. Polski system długo wolał wydawać dziesiątki tysięcy złotych miesięcznie na skrajnie drogie terapie celowane podawane na ślepo, niż zapłacić kilkaset złotych za badanie wskazujące, u kogo mają one jakiś sens. Doprowadziło to do patologicznej sytuacji, w której to koncerny farmaceutyczne, chcąc sprzedać swoje leki, same finansowały badania molekularne, przysyłając do szpitali prywatnych kurierów i konkurując między sobą o materiał tkankowy pacjentów – co urągało wszelkim standardom etycznym i systemowym. Choć tamte dzikie czasy mamy częściowo za sobą, obecna biurokracja wciąż sabotuje postęp medyczny. Kluczowym problemem pozostał brak ustawowych ram czasowych wprowadzania nowych świadczeń diagnostycznych – podczas gdy proces refundacji nowych leków został uregulowany sztywnymi terminami, procedury diagnostyczne takich gwarancji nie mają i ubieganie się o ich refundację może utknąć w ministerialnych i urzędniczych szufladach na długie lata.

Weźmy tzw. płynną biopsję – nieinwazyjne badanie, polegające na wyłapywaniu wolnokrążącego DNA nowotworu z prostej próbki krwi obwodowej pacjenta. To technologiczny ratunek dla chorych na raka płuca, gdy pobranie wycinka z tkanki jest niemożliwe z racji lokalizacji guza, bądź dla pacjentów z rakiem prostaty, w przypadku których archiwalny bloczek parafinowy stracił już swoją wartość biologiczną i warto przyjrzeć się tkance na nowo. Płynna biopsja pozwala monitorować chorobę i wykrywać w czasie rzeczywistym mutacje prowadzące do niewrażliwości na leki. Gdzie tkwi haczyk? W Polsce nie można rozliczyć się z płynnej biopsji zastosowanej w trybie ambulatoryjnym. Aby lekarz mógł zlecić to badanie, musi położyć pacjenta na oddziale i uzasadnić jego kilkudniową hospitalizację tylko po to, by pielęgniarka pobrała jedną probówkę krwi. A w świecie terapii celowanych czas staje się jednym z najważniejszych parametrów leczenia.

Jeszcze innym problemem jest to, że choć Polska dysponuje laboratoriami wykonującymi badania na światowym poziomie, dostęp do nich pozostaje nierówny. W dużych ośrodkach akademickich pacjent może liczyć na kompleksową analizę molekularną. W mniejszych szpitalach bywa z tym znacznie gorzej. Dlatego oczekiwanie na wyniki przeciąga się nieraz ponad miesiąc. A przecież przyszłość dopiero nadchodzi, bo jak zapowiada prof. Perkowska-Ptasińska, wchodzimy w erę patologii cyfrowej. Sekwencjonowanie całogenomowe, analiza pojedynczych komórek, sztuczna inteligencja interpretująca preparaty histopatologiczne – wszystko to zmienia medycynę szybciej, niż system ochrony zdrowia jest zdolny ewoluować. Być może za kilkanaście lat klasyczny mikroskop stanie się dla patologii tym, czym dziś jest stetoskop w kardiologii: ważnym symbolem, ale tylko jednym z wielu narzędzi.

Jedno prawdopodobnie się nie zmieni – nowotwór nadal będzie trzeba najpierw szczegółowo rozpoznać, zanim zacznie się go leczyć. A ekspert odczytujący tę biologiczną zagadkę nadal będzie siedział gdzieś z dala – nad preparatem, którego pacjent nigdy nie zobaczy. I od którego wszystko zależy.