Ssaki po śmierci dają się sklonować

Na początku lat 80. XX wieku w Zakładzie Embriologii UW pojawił się pewien młody człowiek ze słoikiem. Znajdowało się w nim ucho psa. Mężczyzna chciał, żeby dzięki temu fragmentowi ciała sklonować jego zmarłego pupila i tym samym przywrócić do go życia. W tamtych czasach nikt nie potrafił tego dokonać nawet z myszą, a co dopiero psem i to post mortem.

Teraz w „Nature Communication” japońscy embriolodzy z grupy Teruhiko Wakayamy donoszą o klonowaniu myszy przy użyciu martwych komórek jako dawców DNA. To właśnie takie eksperymenty mielibyśmy w sprawie psa wykonać 40 lat temu w Zakładzie Embriologii.

Martwy plemnik zaskakuje, czyli czyje DNA podtrzymuje życie

Wakayama już dawno wykazał, że można uzyskać zdrowe potomstwo wstrzykując do komórki jajowej (oocytu) myszy martwy plemnik. Innymi słowy, wiadomo było, że materiał genetyczny – w tym wypadku chromatyna główki uśmierconego plemnika – może być użyty do procedury imitującej zapłonienie in vitro. Z takim samym efektem, jaki daje żywy plemnik.

Chromatyna to kwas dezoksyrybonukleinowy – DNA zawierające informację genetyczną w postaci genów oraz otaczające je białka. Te dwa elementy tworzące chromatynę są związkami chemicznymi i by trwać nie potrzebują procesów życiowych. Te są zaś niezbędne do odczytywania zapisanej w DNA informacji genetycznej, jej powielania i budowania nowego życia poprzez aktywację i inaktywację genów.

Dlatego sam fakt, że DNA martwego plemnika może dawać i propagować życie, był zaskoczeniem tylko do pewnego stopnia. W swojej pracy Japończycy pokazują, że podobnie jest w przypadku jąder komórek pobranych z ciała myszy. Z tym że DNA plemnika zawiera pojedynczy (haploidalny) zestaw genów ojcowskich. W dodatku bardzo ściśle upakowany, o prawie krystalicznej strukturze, dzięki protaminom – białkom jądrowym zastępującym w jądrze plemnika histony obecne w innych komórkach. Po wprowadzeniu do oocytu stanowiło ono tylko połowę materiału genetycznego nowo utworzonego zarodka, gdyż druga połowa pochodziła z samego oocytu.

DNA martwej komórki skóry czy komórki folikularnej (rodzaj komórek odżywczych i wspomagających rozwój i funkcjonowanie oocytów), których użyli do swoich doświadczeń Japończycy, zawiera zaś diploidalną ilość DNA. Po wprowadzeniu do oocytu pozbawionego własnego DNA jądrowego w procesie klonowania, tylko to DNA podtrzymuje procesy życiowe. Dodatkowo, jądra takich komórek są zbudowane z luźno ułożonej chromatyny, a ich DNA nie jest tak gęsto upakowane jak w plemniku i jest połączone z wieloma różnymi histonami – białkami chroniącymi je i kontrolującymi jego funkcje. Dlatego fakt, że jądro o tak luźnej strukturze pochodzące z martwej komórki mogło z powodzeniem przeprowadzić proces rozwoju sklonowanego zarodka, jest dużym zaskoczeniem.

Samiec stwarza płodne samice, czyli jak z kariotypu XY powstaje X0

Ale wróćmy do samego doświadczenia Wakayamy. Otóż Japończycy mrozili komórki zgodnie ze standardowymi metodami pozwalającymi na konserwacje materiału biologicznego: do -30°C, następnie do -80°C, w końcu w ciekłym azocie o temperaturze -195,8°C. W tym momencie przeprowadzali osuszanie próbek, czyli liofilizację. Ten proces zabija komórki, ponieważ usuwa ich wewnętrzne i zewnętrzne błony oraz powoduje krystalizację wody, która niszczy ich strukturę. Pozwala natomiast na długotrwałą i łatwą konserwację materiału biologicznego bez konieczności przechowywania go w specjalnych warunkach. Może też zachowywać DNA w dość dobrym, choć na pewno nie w idealnym, stanie. I o to właśnie chodziło ekipie Wakayamy.

W następnym etapie doświadczenia wprowadzali oni pod mikroskopem liofilizowane jądro komórkowe do oocytu pozbawionego własnego materiału genetycznego. Dokonywali zatem klasycznego klonowania, podobnego do procedury użytej do powołania do życia słynnej owcy Dolly ponad 25 lat temu. Oczywiście najważniejsza różnica polegała na tym, że jądro komórkowe użyte jako źródło DNA pochodziło z martwej komórki poddanej zamrożeniu, rozmrożeniu i liofilizacji.

Rozwój podejmowała bardzo mała część tak uzyskanych sklonowanych zarodków: początkowo było to tylko 0,1 proc. Po dalszym usprawnieniu metody podniesiono wydajność do 2,1 proc. (cały czas mowa wyłącznie o uzyskiwaniu zarodków złożonych z ok. 100 komórek w stadium blastocysty). Jednym z głównych powodów tak niskiej wydajności były poważne kłopoty z prawidłowym rozdzieleniem chromosomów w trakcie podziałów zarodkowych. Ujawniały się zmiany wywołane w DNA przez mrożenie, rozmrażanie i wysuszanie. Jednak nawet tak ograniczone pozytywne wyniki pozwoliły na uzyskanie kilku sklonowanych blastocyst.

U zwyczajnych zwierząt po jednym chromosomie X zawierają wszystkie oocyty, a u tych podwójnie sklonowanych – tylko połowa. Ale to wystarczyło, by „nowe” myszy były płodne.

Naukowcy umieścili te zarodki w szalkach hodowlanych i uzyskali z nich zarodkowe komórki macierzyste. Te, dzięki namnożeniu w hodowli laboratoryjnej, były już bardzo liczne. Teraz embriolodzy mieli bardzo dużo materiału – już żywego – do przeprowadzenia drugiej rundy klonowania. Ich zamysł był taki, że uzyskane komórki macierzyste powinny być wyselekcjonowane tak, że ich DNA było nienaruszone.

I nie pomyli się. Przenosili jądra komórkowe komórek macierzystych uzyskanych z pierwotnych klonów do kolejnych oocytów pozbawionych własnego materiału genetycznego. One rozwijały się o wiele lepiej niż te pierwotne. I te naukowcy przeszczepiali do dróg rodnych samic myszy.

Ostatecznym wynikiem eksperymentu był rozwój po dwakroć sklonowanych zwierząt. W zależności od doświadczenia Japończycy uzyskali od 0,2 do 5,4 proc. sklonowanych myszy, co jest wynikiem bardzo podobnym do klonowania z użyciem zwykłych, żywych komórek pobieranych bezpośrednio z myszy lub z hodowli komórkowej.

Co ciekawe, z linii komórkowej wyprowadzonej z wyjściowych komórek pobranych od samca, Japończycy uzyskali w drodze klonowania liczne samice. Jak to jest możliwe? Naukowcy zbadali kariotyp (skład chromosomów) sklonowanych samic i okazało się, że brakuje im chromosomu Y. Na którymś etapie manipulacji komórki macierzyste pochodzące ze sklonowanego zarodka płci męskiej stały się komórkami żeńskimi o kariotypie X0. Co ciekawe, „nowe” myszy były płodne. Część ich oocytów zawierała chromosom X, tak jak się to dzieje u normalnych samic, posiadających dwa chromosomy X (po dwa chromosomy X w diploidalnych komórkach somatycznych i jeden X w haploidalnych oocytach). Tyle że u tych zwyczajnych po jednym chromosomie X zawierają wszystkie oocyty, a u tych podwójnie sklonowanych – tylko połowa. Było to jednak wystarczające do uzyskania przez nie potomstwa.

Putin boi się klona, czyli czy Japończycy pokazali, jak tworzyć nowych ludzi

Japończycy sądzą, że ich metoda klonowania – jeśli zostanie ulepszona i zwiększy się jej wydajność – będzie miała zastosowanie w ratowaniu ginących gatunków ssaków właśnie przez klonowanie. Nie trzeba będzie przechowywać pobranych od nich komórek w warunkach utrzymujących je przy życiu, co jest zabiegiem bardzo kosztownym i ryzykownym, gdyż przy braku odpowiedniej ilości płynnego azotu mogą ulec zniszczeniu. Zamiast tego można będzie zasoby takiego banku komórek po prostu liofilizować i przechowywać w szufladzie biurka lub w szafie. Eksperyment pokazuje też, że nawet jeśli ostatnim osobnikiem z danego gatunku będzie samiec, to odtworzenie samic teoretycznie będzie możliwe.

Doświadczenia Japończyków mogą mieć jeszcze jedno potencjalne zastosowanie: do klonowania ludzi. Niedawno obiegła media informacja, że Władimir Putin w trakcie swych wizyt zagranicznych przemieszczał się z workiem, do którego jego podwładni zbierali jego odchody. Wszystko to po to, aby nie zostawiać po sobie śladów, które mogłyby posłużyć do identyfikacji jego DNA i jego genów, a tym samym z dostarczyć zachodnim wywiadom informacji o słabych punktach w genach dyktatora i o jego potencjalnych chorobach. Czy do tych obaw dojdzie teraz i ta, że zachodnie wywiady mogłyby użyć jego martwych komórek – np. z włosów czy naskórka – do jego sklonowania? Do niedawna taki pomysł zostałby wyśmiany. Ale po ukazaniu się publikacji Japończyków można już go brać bardziej na serio.

Tylko po co klonować Putina, skoro z tym jednym mamy tyle problemów? Odpowiedź znają wyłącznie obce wywiady.