Rentgenowskie kino, czyli zdjęcia z femto-sekundową migawką

W Sekcji Archeo w pulsarze prezentujemy archiwalne teksty ze „Świata Nauki” i „Wiedzy i Życia”. Wciąż aktualne, intrygujące i inspirujące.

W podziemnym laboratorium, głęboko pod wzgórzami wokół Palo Alto naukowcy krzątają się w pośpiechu, przygotowując seryjne eksplozje. Kontrolowane wybuchy malutkich kryształków białek mają pomóc im w wyjaśnieniu jednej z największych tajemnic przyrody: jak rośliny dzięki fotosyntezie przekształcają energię światła w energię chemiczną. W razie sukcesu przybliżą się o krok do praktycznie niewyczerpanego źródła czystej energii.

Był grudzień 2009 roku. Zespół zmęczonych i mocno niewyspanych naukowców oraz studentów od wielu dni bez przerwy przygotowywał w SLAC National Accelerator Laboratory eksperyment wymagający najsilniejszego na świecie lasera rentgenowskiego, Linac Coherent Light Source (LCLS), który emituje promieniowanie dzięki elektronom poruszającym się prawie tak szybko, jak światło. Jedna z grup gorączkowo regulowała iniektory, który miały wstrzeliwać malutkie kryształki w wiązkę promieniowania rentgenowskiego. Inna przygotowała i ładowała do iniektorów kryształki złożone z kompleksu białkowego znanego jako fotosystem I, który odpowiada za przebieg fotosyntezy.

Na końcu tunelu akceleratora długości przeszło 3 km kryształki jeden po drugim trafiały w obszar silnej wiązki laserowej. I chociaż niszczące promieniowanie niemal natychmiast doprowadzało do rozerwania cząsteczek, to wcześniej pozwalało wykonać ich zdjęcia. Zastosowana wtedy po raz pierwszy nowa metoda pomiarowa miała umożliwić rejestrowanie w femtosekundowych odstępach czasu (femtosekuda to 1·10^–15 sekundy) całych ciągów obrazów i łączenie ich w filmy, otwierając drogę do wyjaśnienia procesów biologicznych w najmniejszej skali.

Fizyk Richard Feynman powiedział kiedyś: „Wszystkie procesy w organizmach żywych da się wytłumaczyć jako podskakiwanie i kołysanie się atomów”. Nigdy wcześniej nie potrafiliśmy jednak zaobserwować bezpośrednio i z wymaganą szybkością ruchu atomów i molekuł w żywych organizmach. Nasza metoda, seryjna krystalografia femtosekundowa (SFX – Serial Femtosecond Crystallography) pozwala obserwować z olbrzymią rozdzielczością czasową taniec molekuł, który, na przykład, może ujawnić, w jaki sposób cząsteczki leku oddziałują na chore komórki albo jak energia chemiczna ulega przemianie na inne formy energii.

Zespoły badawcze z różnych laboratoriów na świecie wykorzystywały już pomiary SFX, aby wyjaśnić działanie eksperymentalnego leku regulującego ciśnienie krwi, dając szansę na skuteczniejsze przeciwdziałanie chorobie nadciśnieniowej. Dzięki SFX poznano też strukturę enzymu niszczącego czerwone ciałka krwi w śpiączce afrykańskiej, śmiertelnej chorobie wywoływanej przez pasożyty. Zaobserwowano też początkowe etapy fotosyntezy, których efektem jest między innymi rozszczepienie cząsteczki wody na tlen i wodór.

Nie ukrywamy, że kiedy w 2009 roku w podziemnym laboratorium zaczynaliśmy niszczyć z wysiłkiem wyhodowane kryształki za pomocą wiązki z lasera rentgenowskiego, graliśmy o wysoką stawkę. Wielu naszych kolegów naukowców twierdziło, że proponowana przez nas metoda nie ma szansy zadziałać, a to skutkowało odrzucaniem kolejnych wniosków o granty na badania. I wtedy na ekranie komputera zaczęły pojawiać się piękne wzory dyfrakcyjne tworzone przez rozpraszane promieniowanie rentgenowskie. W naszej pamięci ciągle żywe są okrzyki radości, jakie rozległy się w laboratorium, kiedy na naszych oczach rodziła się nowa gałąź pomiarów rentgenowskich.

Rentgenowskie kino

Jeszcze przed wymyśleniem SFX naukowcy czynili wspaniałe postępy w śledzeniu zmian zachodzących w niektórych strukturach chemicznych, ale przebieg procesów w najdelikatniejszych i najbardziej złożonych układach biologicznych wymykał się wszelkim próbom obserwacji. W latach 80. nieżyjący już chemik Ahmed H. Zewail oprawcował metodę pozwalającą wykryć ruch atomów podczas reakcji chemicznych, używając do tego ultrakrótkich impulsów laserowych z zakresu widzialnego. Jednak ich długość fali była zbyt duża, aby rozdzielić najdrobniejsze szczegóły struktur białkowych. W późniejszych latach olbrzymi postęp w dziedzinie technik mikroskopowych pozwolił otrzymać obrazy białek i wirusów o rozdzielczości bliskiej atomowej. Jednak pomiary nie były dostatecznie szybkie, by dało się obserwować błyskawiczne reakcje związane na przykład z fotosyntezą.

Do badania przebiegu reakcji biologicznych postanowiliśmy więc wykorzystać promieniowanie rentgenowskie, które pozwala połączyć odpowiednią szybkość i rozdzielczość. Aby osiągnąć nasz cel, musieliśmy znaleźć sposób, który pozwoliłby uzyskać rentgenowski obraz cząsteczek na chwilę przed ich unicestwieniem. Tradycyjny sposób używany przez naukowców polega na mozolnym hodowaniu dużych kryształów z białek lub innych cząsteczek, a następnie mapowaniu położeń atomów. W tym celu kryształy oświetla się wiązką promieniowania rentgenowskiego i bada się jej rozpraszanie, czyli dyfrakcję. Cząsteczki w kryształach zajmują ściśle określone położenia i dlatego znajomość rozkładu natężenia rozproszonego promieniowania pozwala naukowcom wyznaczyć rodzaj i współrzędne atomów. Technika ta jest nazywana krystalografią rentgenowską lub rentgenografią. Nasza krystalografia femtosekundowa pozwala uwidocznić struktury atomowe na tej samej zasadzie, ale jest o wiele szybsza.

Niestety, promieniowanie rentgenowskie niszczy cząsteczki, które chcemy oglądać. W powszechnym przekonaniu zastosowanie lasera rentgenowskiego, który wytwarza promieniowanie o dużym natężeniu, powinno jeszcze przyspieszyć ten proces. Wiązka z lasera bez trudu dziurawi stal. Można by więc przypuszczać, że delikatne cząsteczki biologiczne nie będą mieć żadnych szans. Naszym celem było wyprzedzenie zniszczenia spowodowanego przez promieniowanie rentgenowskie i zarejestrowanie obrazów w ciągu femtosekund. Aby lepiej wytłumaczyć, na czym polega trudność, wyjaśnijmy, że różnica między femtosekundą a sekundą jest taka jak między sekundą a 32 mln lat. Dla techniki SFX kluczowy jest praktycznie nieuchwytny okruch czasu pomiędzy chwilą dotarcia impulsu do cząsteczki a momentem, kiedy promieniowanie zacznie odrywać elektrony od tworzących ją atomów. Przewaga ładunku dodatniego powoduje rozszerzanie się cząsteczki i w końcu jej rozerwanie.

Oto jak działa nasza metoda. Zaczynamy od stworzenia warunków, w których cząsteczki, oddziałując między sobą, połączą się w malutkie kryształki. Następnie oświetlamy je niezmiernie krótkimi impulsami promieniowania z lasera rentgenowskiego o dużym natężeniu, które trwają tylko tyle, aby część promieni uległa dyfrakcji, zanim cząsteczki zostaną rozerwane. Detektor rejestruje rozkład natężenia rozproszonego promieniowania, co pozwala nam ustalić rodzaj i położenie atomów w białku. Porównując obrazy dyfrakcyjne kryształków białka różniących się orientacją względem wiązki promieniowania rentgenowskiego, możemy odtworzyć przestrzenną strukturę cząsteczek. Ponieważ potrafimy rejestrować obrazy w różnych momentach zachodzącej reakcji, możemy tworzyć z nich kolejne klatki filmu.

Skrystalizowany obraz

Pierwszy krok w kierunku filmowania cząsteczek uczynili w 2000 roku dwaj biofizycy Janos Hajdu i Richard Neutze, którzy pracując wtedy w Uppsala Universitet, obliczyli, że cząsteczki zaczną rozpadać się już po 10 femtosekundach od oświetlenia ich przez promieniowanie rentgenowskie. Oznaczało to, że obrazy trzeba zarejestrować w jeszcze krótszym czasie. W 2006 roku Henry Chapman, obecnie w Deutches Elektronen Synchrotron (DESY) w Hamburgu, razem ze współpracownikami zdołali zrealizować w praktyce ideę „zaobserwuj dyfrakcję i zniszcz”, uzyskując obraz o niskiej rozdzielczości rysunku dwóch malutkich kreskowych figurek i słońca, który wytrawiono w cienkiej warstwie azotku krzemu.

Nie było jednak oczywiste, że metoda sprawdzi się w przypadku delikatnych cząsteczek biologicznych. Znaczna część środowiska podchodziła z rezerwą do naszych zamiarów. Wystarczy powiedzieć, że 10 pierwszych wniosków o przyznanie grantu zostało odrzuconych. Sceptycy twierdzili, że albo nie uda się uzyskać dostatecznie krótkich impulsów laserowych, albo że kryształki białek będą zbyt małe, aby dało się zaobserwować promieniowanie ulegające dyfrakcji, albo że nie poradzimy sobie z wyznaczeniem orientacji kryształu w chwili oświetlenia go promieniowaniem rentgenowskim.

Wierzyliśmy jednak, że skoro, jak wykazał Chapman, można uzyskać obrazy innych cząsteczek, my poradzimy sobie z białkami. Zdecydowaliśmy (Fromme), że do sprawdzenia skuteczności SFX użyjemy jednego z najtrudniejszych obiektów badawczych, o jakim można było pomyśleć: fotosystemu I. Kompleks zawierający 36 białek oraz przeszło 300 absorbujących światło pigmentów zielonych i pomarańczowych należy do najbardziej złożonych struktur białkowych, jakie dotychczas badano metodami rentgenowskimi.

Fromme dobrze znała fotosystem I, ponieważ przez wiele lat zajmowała się jego krystalizacją i badaniem struktury innymi metodami. Wspólnie uznaliśmy więc, że wybór struktury biologicznej o dużych rozmiarach jest zaletą, ponieważ nawet w razie zarejestrowania niewielkiej liczby wzorów dyfrakcyjnych, uzyskamy obraz o niskiej rozdzielczości, który jednak da się zidentyfikować jako fotosystem I. Nasz plan zdołaliśmy zrealizować w 2009 roku, pracując w podziemnym laboratorium.

Małe jest piękne

Aby zarejestrować zdjęcia, musieliśmy mieć kryształy fotosystemu I. Dla potrzeb konwencjonalnej krystalografii hoduje się zwykle duże kryształy, które dają wystarczająco silne wiązki dyfrakcyjne, aby na ich podstawie można było zrekonstruować strukturę białka. Jednak w przypadku białek otrzymanie dużych kryształów o dobrej jakości wymaga wielu lat pracy doświadczalnej. W niektórych przypadkach zadanie to jest praktycznie niewykonalne. Jednym z nich jest właśnie fotosystem I.

Na szczęście, metoda SFX zadowala się nanometrowymi kryształkami, które o wiele łatwiej otrzymać w laboratorium. Jednak używanie nanokryształków oznacza nowe wyzwania. Nie dość, że trzeba uzyskać dostatecznie duże natężenie promieniowania rozproszonego przez tak małe obiekty, to jeszcze trzeba rozwiązać inne problemy fizyczne. Jak śledzić obiekty zbyt małe dla mikroskopu i precyzyjnie skierować je w wiązkę promieniowania rentgenowskiego, powtarzając całą operację 120 razy na sekundę?

Trzeba było wymyślić nową metodę, która pozwoli nam widzieć nanokryształki. Jedno z zastosowanych przez nas rozwiązań kryje się pod skrótem SONICC (second-order nonlinear imaging of chiral crystals – drugorzędowe nieliniowe obrazowanie kryształów chiralnych), którego idea polega na absorpcji przez kryształ dwóch ultrakrótkich impulsów promieniowania podczerwonego i wyemitowaniu światła zielonego, co sprawia, że nanokryształki rozbłyskują jak robaczki świętojańskie w nocy.

Kolejnym problemem było wprowadzanie kryształków w tor wiązki rentgenowskiej, dokładnie w chwili pojawienia się impulsu promieniowania. W tym celu zaprojektowaliśmy (Spence) wraz z Uwe Weierstallem, fizykiem z Arizona State University, oraz Bruce’em Doakiem, urządzenie, które działa podobnie do głowicy drukarki atramentowej i wstrzykuje strumień roztworu z nanokryształkami w wiązkę promieniowania rentgenowskiego. Iniektor działa tak precyzyjnie, że kryształki podążają do wiązki wzdłuż jednej linii.

Aby zapobiec zatykaniu się iniektora i odcięciu strumienia nanokryształków, Weierstall musiał zaprojektować odpowiednio szeroką dyszę, która mimo to może wytwarzać bardzo wąski strumień. Było to możliwe dzięki umieszczeniu dyszy w strudze gazowego helu, który ogniskuje wiązkę nanokryształów do średnicy będącej niewielkim ułamkiem średnicy ludzkiego włosa; średnica samej dyszy jest przeszło 10 razy większa.

Kiedy już cały nasz układ eksperymentalny był gotowy, okazało się, że pozostał jeszcze jeden poważny problem: jak poradzić sobie z prawdziwym potopem danych. Jeden eksperyment może dostarczyć nawet 100 terabajtów, wystarczająco dużo, aby zapełnić 25 dysków komputerów osobistych wyższej klasy. Żeby zrekonstruować strukturę 3D, trzeba pośród dziesiątków tysięcy obrazów dyfrakcyjnych odnaleźć te, które odpowiadają kryształkom o właściwej orientacji. Dzięki współpracy z Richardem Kirianem i Thomasem White’em z zespołu Chapmana z DESY, udało się nam stworzyć oprogramowanie, które potrafi zamienić prawdziwe tsunami danych w precyzyjne trójwymiarowe obrazy cząsteczek.

Krok po kroku doskonaliliśmy metodę. Do 2014 roku nasza praca zaowocowała zaobserwowaniem w czasie rzeczywistym przeniesienia elektronu pomiędzy dwoma głównymi graczami w procesie fotosyntezy: dużym kompleksem białkowym odpowiedzialnym za absorpcję światła słonecznego znanym jako fotosystem I a białkiem nazywanym ferredoksyną. Kiedy światło pada na fotosystem I, uwalniane są elektrony, które następnie zabiera ferredoksyna w celu przemiany CO₂ na cząsteczki biologiczne. Kiedy ferredoksyna oddala się, kryształki białkowe ulegają szybkiemu rozpuszczeniu, sprawiając, że śledzenie przebiegu reakcji jest niezwykle trudne. Tylko ultraszybka metoda SFX umożliwia dostrzeżenie błyskawicznych zmian.

Następny problem z tej serii będący zresztą głównym przedmiotem zainteresowania Fromme jako biochemiczki jest wyjaśnienie, w jaki sposób rośliny rozszczepiają wodę na wodór i tlen, wykorzystując do tego światło i metale występujące obficie na Ziemi. Rozszczepianie wody w sposób, jaki czynią to rośliny, mogłoby otworzyć drogę do taniego wodoru, który od dawna jest świętym Graalem rozwijającego się sektora gospodarki opartej na odnawialnych źródłach energii.

Udało nam się zarejestrować pierwsze obrazy procesu rozszczepiania wody, które mimo niskiej rozdzielczości pozwoliły dostrzec istotne zmiany struktury kompleksu białkowego znanego jako fotosystem II. W ostatnim czasie zespół Jian-Ren Shen z Uniwersytetu Okayama, stosując technikę SFX, uzyskał podobne obrazki, ale ujawniające więcej szczegółów. Pracujemy obecnie nad wykonaniem filmu o wysokiej rozdzielczości, który uwidoczniłby kolejne etapy procesu na poziomie atomowym i pozwolił w ten sposób wyjaśnić sekrety fotosyntezy.

Projektowanie leków

Teraz, kiedy wiemy już, jak badać przebieg reakcji za pomocą metody SFX, mamy nadzieję, że filmy nie tylko otworzą drogę do przełomowych odkryć naukowych, ale także, i to w krótszej perspektywie, pomogą w poszukiwaniu nowych leków. Tę możliwość dostrzegliśmy, badając blokery receptora angiotensyny II (ARB). Leki z tej grupy oddziałują z receptorem komórkowym hormonu zwanego angiotensyną II, który odpowiada za regulację ciśnienia krwi. Są więc używane w leczeniu nadciśnienia, które w USA jest główną przyczyną niewydolności serca i udarów. Choć leki tego typu zaliczane do pierwszej generacji potwierdziły swoją skuteczność, to jednak miały też wadę – słabe wiązanie się z receptorami. Dlatego trzeba było je podawać w dużych dawkach, co potęgowało działania niepożądane, jak bóle i zawroty głowy, a czasem również obrzęk twarzy i gardła.

Nasze badania pozwoliły odkryć przyczynę słabego wiązania: okazało się, że cząsteczki leku po prostu nie pasują do receptora i dlatego wiele z nich od niego odpada. Było jednak oczywiste, że struktura receptora nie wyklucza istnienia cząsteczek, które będą wiązać się z nim bardziej efektywnie, a przez to skuteczniej regulować ciśnienie krwi. Jeden z nowych leków o nazwie ZD7155 jest już w fazie badań.

W podobny sposób można udoskonalić wiele innych leków. Receptory angiotensyny II należą do liczniejszej i bardzo ważnej grupy receptorów komórkowych, znanych jako receptory sprzężone z białkami G. Cząsteczki te rozmieszczone na powierzchni komórki pozwalają odbierać bodźce ze środowiska i reagować. Naukowcy, którzy pierwsi odkryli strukturę i zbadali działanie tej klasy receptorów na nie, otrzymali w 2012 Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Kluczowa rola receptorów sprzężonych z białkami G dla funkcjonowania i rozwoju komórki sprawia, że są one celem działania nowych leków. Możliwość obserwowania, jak zmieniają się te struktury, ułatwiłaby chemikom z firm farmaceutycznych projektowanie nowych leków, które byłyby precyzyjnie dopasowane do receptorów i oddziaływałyby na ich stany aktywne, zmniejszając prawdopodobieństwo występowania działań niepożądanych.

„Wykazaliśmy, że dla wszystkich istniejących dotychczas modeli cząsteczkowych próby przewidzenia, jak receptor i lek do siebie pasują, w wielu ważnych szczegółach były obarczone błędami” – stwierdza Vadim Cherezov z University of Southern California, który prowadził eksperymenty z angiotensyną II. W szczególności pomiary SFX ujawniły różnice pomiędzy strukturą receptorów sprzężonych z białkami G w temperaturze pokojowej i w warunkach kriogenicznych, w których zwykle otrzymuje się kryształy do badań. Oznacza to, że lekarstwa zaprojektowane dla receptorów na podstawie badań w niskiej temperaturze nie będą tak samo skuteczne po zastosowaniu ich w temperaturze ludzkiego organizmu. (Zdarza się też, że lekarstwa oddziałują równocześnie na zbyt dużą grupę receptorów. Problem ten dotyczy, na przykład, substancji używanych w leczeniu śpiączki afrykańskiej. Nasze filmy wykazały, że substancja oddziałuje w podobny sposób z białkami pasożyta, który powoduje chorobę, jak i białkami w ludzkich komórkach. Zarejestrowane obrazy dają szansę chemikom na opracowanie cząsteczek, które będą selektywnie oddziaływać tylko na białka pasożyta, a nie człowieka).

Tajemnica widzenia

Ekscytuje nas obserwowanie, jak inni badacze wykorzystują metodę SFX. Przykładem jest Marius Schmidt z University of Wisconsin–Milwaukee, który wraz ze swoim zespołem sięgnął niedawno do techniki filmowania cząsteczek, aby wyjaśnić, jak widzą nasze oczy. Chociaż zwykle nie uważamy bakterii za organizmy obdarzone zmysłem wzroku, to jednak występują w nich białka reagujące na światło, które są ewolucyjnymi prekursorami białek w naszych narządach wzroku. Wykonując kolejne zdjęcia w odstępach czasu krótszych niż kiedykolwiek w przeszłości, zespół odtworzył sekwencję ultraszybkich procesów, ujawniając, w jaki sposób białka bakterii reagują na światło.

Naukowcy wykorzystali technikę SFX do badania reakcji na światło skrystalizowanych białek. Kolejne obrazy przedstawiają zmiany zachodzące w odstępach czasu krótszych niż bilionowa sekundy. W szczególności udało się wyznaczyć położenia przemieszczających się atomów białka w chwili, kiedy znajdująca się w nim cząsteczka barwnika w odpowiedzi na światło zmienia kolor na żółty. Ten stan ma kluczowe znaczenie dla percepcji światła przez wszystkie żywe organizmy, w tym bakterie i rośliny; u ludzi jest pierwszym etapem w procesie widzenia.

„To w niezwykle istotny sposób przybliża nas do zrozumienia chemii odpowiedzialnej za życie” – przewiduje Schmidt. Jesteśmy przekonani, że przyszłość krystalografii białek, a także nasza wiedza na temat przyrody, tkwi w technice SFX. Być może za 10 lat struktury białkowe nie będą już ilustrowane za pomocą rysunków, lecz filmów 3D.

Petra Fromme jest profesorem (Paul V. Galvin Professor) w School of Molecular Sciences oraz dyrektorem Center for Applied Structural Discovery w Arizona State University.

John C. H. Spence jest profesorem fizyki (Richard Snell Professor) na Arizona State University oraz dyrektorem naukowym BioXFEL Science and Technology Center.