Oko w oko z koronawirusem

Doświadczenie 1

Na stronie www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/ kliknij na „search by virus” i w polu wyszukiwania wpisz „sars-cov2”, po czym wybierz z pola podpowiedzi „Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 taxid: 2697049”. Pojawia się tabela z danymi o wirusie – „Host” wskazuje, z jakiego organizmu wyizolowano wirusa (Homo sapiens oznacza zakażonych ludzi), „Geo location” – kraj lub region, w którym chorował pacjent, „Accesion” to numer porządkowy w bazie. Chcąc sprawdzić, czy wirusy z poszczególnych miejsc różnią się od siebie, zaznacz pola przy numerach NC_045512; MT444516; MT444627; MT447165 i MT270814. Jeśli nie możesz ich znaleźć – po lewej stronie tabeli pod numerem „taxid: 2697049” kliknij w „+” przy polu „Accession” i w polu wyszukiwania wpisz kody. Zatwierdź, klikając na „Submit”. Zaznacz pola z lewej strony przy numerach i kliknij „Build Phylogenetic tree” (pasek na górze).

Wyjaśnienie: Naukowcy chcą się dowiedzieć, jak działa wirus SARS-CoV-2 i czym się różni od mniej groźnych koronawirusów wywołujących „zwykłe” przeziębienie. W tym celu badają sekwencję RNA korononawirusa pobranego od danego pacjenta. Porównując dane od wielu pacjentów, można zobaczyć, jak wirus ewoluuje – za każdym razem, gdy powiela się w ludzkich komórkach, może dojść do mutacji, którą odziedziczą wszystkie potomne wirusy. Po pewnym czasie nastąpi kumulacja tych zmian. Część z nich może wpłynąć na przebieg choroby (zakaźność, nasilenie objawów, śmiertelność), a wszystkie mają znaczenie diagnostyczne – pozwalają m.in. ustalić, skąd przybył wirus. Ilustruje to prosty model pokrewieństwa – wariant z Wuhan jest bardzo podobny do wykrytego w Hongkongu, ich odleglejszym krewniakiem jest wirus wyizolowany w Tajlandii. Wirusy z USA są do siebie bardzo podobne, dzieli je natomiast odleglejsze pokrewieństwo z tymi z Azji.

Doświadczenie 2

Jak dokonuje się oceny pokrewieństwa wirusów? Porównuje się sekwencje (ułożenie) reszt zasad (adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy/ uracylu), budujących materiał genetyczny. Wróć do karty z wybranymi szczepami wirusa i kliknij w „NC_045512”, a potem w ten sam numer w nagłówku pojawiającego się okna. Znajdź sekcję „ORIGIN”. To zapis reszt zasadowych tworzących cały genom wirusa – ok. 29 tys. par zasad! Porównując go litera po literze z innymi genomami, można znaleźć mutacje różniące poszczególne szczepy. By tego dokonać, wróć do karty z wybranymi szczepami wirusa, zaznacz pola przy każdym z numerów i kliknij przycisk „Align” (na górze). Poczekaj. Pod napisem „Multiple Alignment” znajdziesz graficzny model genomu w formie szarego paska z zaznaczonymi na czerwono różnicami. Klikając myszą, zaznacz na górnym pasku fragment od 25550 do 26000. Poniżej tego paska znajdziesz przycisk „ATG”, na który należy kliknąć. Poniżej pojawia się powiększenie górnego paska, ale z widocznymi literami, odpowiadającymi resztom zasad. Klikając w te litery i przeciągając myszką w prawo lub lewo, znajdź pozycję 25565. W szczepach azjatyckich w tych pozycjach oryginalnie jest G. Szczep wirusa, który dotarł do USA, jest mutantem zawierającym w tym miejscu uracyl, czyli po przepisaniu na DNA – tyminę.

Doświadczenie 3

Dla naukowców ważne jest jednak, co koduje dana sekwencja. Otwórz www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2?report=graph, by zobaczyć, co produkuje wirus w zakażonych komórkach. Każdy z zielonych pasków odpowiada instrukcjom do produkcji białek koniecznych do rozwoju wirusa na określonym stadium ataku – w tym dużych 29 białek, od regulatorowych poprzez enzymy aż do elementów budulcowych, z których składane są nowe wirusy. Jednym z nich jest białko S (ang. spike), „kolec” służący do przyczepiania się wirusa do ludzkich komórek. Po najechaniu kursorem na drugi co do długości zielony (lub czerwony) pasek i wybraniu z okienka opcji „FASTA View” można zobaczyć sekwencję nukleotydów (lub reszt aminokwasowych) kodujących lub tworzących to białko.

Na stronie https://swissmodel.expasy.org/repository/species/2697049 można natomiast znaleźć model tego białka (wyszukaj słowo „spike”). Gdy kliknie się w jeden z obrazków, otwiera się strona z obrotowym modelem 3D tego białka. Nie mówi on jednak, jak działa ono podczas ataku wirusa. Naukowcy usiłują się tego dowiedzieć, wykorzystując modelowanie molekularne – wyliczają, jak zachowają się poszczególne cząsteczki, gdy wejdą ze sobą w kontakt. Pozwala to także przetestować lub przewidzieć działanie leków przeciw koronawirusowi. Ty także możesz wziąć udział w tych badaniach, udostępniając zasoby swojego komputera do obliczeń poprzez program ze stron https://foldingathome.org lub https://boinc.bakerlab.org.

Doświadczenie 4

Znajomość unikalnych sekwencji genomu wirusa SARS- CoV- 2, odróżniających go od innych koronawirusów, pozwala opracować precyzyjne testy diagnostyczne. Najczęściej stosuje się w tym celu technikę PCR – łańcuchową reakcję polimerazy namnażającą wybrany fragment DNA z matrycy, czyli próbki materiału genetycznego koronawirusa (np. wymaz od pacjenta). Wybór określają startery – krótkie syntetyczne fragmenty DNA (produkowane na zamówienie przez firmy biotechnologiczne) dodawane do mieszaniny reakcyjnej. Startery łączą się w sposób komplementarny (G łączy się z C, natomiast A z T) do matrycy – jeśli starter zawiera sekwencję TGTGT, to będzie szukał miejsca w wirusowej matrycy z sekwencją ACACA i nie połączy się np. z CCAACA. Powielany będzie tylko fragment pomiędzy starterami, a jego obecność można wykryć na wiele sposobów. Jeśli nie będzie pasującej matrycy, nie powstanie produkt reakcji, co oznacza wynik ujemny i brak zakażenia koronawirusem. Całe badanie trwa zaledwie kilka godzin. Startery stosowane w diagnostyce pasują tylko do określonych fragmentów DNA danego (i żadnego innego) szczepu koronawirusa. Startery nie mogą też przypadkiem pasować do ludzkiego genomowego DNA. Aby zaprojektować przykładowe startery, na stronie www. ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast w dużym białym okienku z podpisem „Enter accession, gi, or FASTA sequence” wpisz „NC_045512.2” (kod genomu wirusa z Wuhan). W sekcji „PCR product size” wpisz „min=70 max=150”. Przewiń na dół strony i kliknij „Get Primers”. Poczekaj kilka minut. Zobaczysz znajomy model genomu koronawirusa z zaznaczonymi na niebiesko proponowanymi miejscami namnażania DNA w reakcji PCR.

dr Paweł Jedynak, Szymon Kwaśnik
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ

***

Wiedza w pigułce

Nawet co piąte przeziębienie wywołują koronawirusy, ale co kilka lat (ostatnio w latach 2002 i 2012) pojawiają się szczepy o szczególnie dużej zjadliwości. Wirusy nie prowadzą własnego metabolizmu (z tego powodu wielu nie uważa ich za żywe twory). Mogą jedynie pasożytować na komórkach i zmuszać je do powielania swoich kopii. Poza komórką są całkowicie bierne. Nie potrafią nawet aktywnie zaatakować żywiciela – jak stwierdzono, to komórka musi aktywnie pochłonąć najeźdźcę. Wirus SARS- CoV- 2 wykorzystuje w tym celu podobieństwo swojego „kolca” („opakowanie” wirusa pokryte jest takimi tworami) do angiotensyny – ważnego hormonu krążącego w naszej krwi, wpływającego na gospodarkę mineralną i funkcjonowanie nerek oraz zwiększającego ciśnienie krwi. Organizm subtelnie reguluje działanie angiotensyny także bezpośrednio w docelowej tkance (np. w płucach), przekształcając ją w inaczej działającą formę poprzez obecny na powierzchni komórek enzym o skrócie ACE2. Same komórki też regulują aktywność ACE2 – w razie potrzeby zasysają go do swego wnętrza, czasem razem z przyczepionym wirusem, tworząc pęcherzyk. Tu do dzieła wkracza białkowo--lipidowe „opakowanie” wirusa (jego skład wpływa na to, że detergenty są tak skuteczną bronią przeciw tym wirusom) – łączy się ono z pęcherzykiem zassanym z powierzchni, co prowadzi do uwolnienia RNA wirusa wprost do cytoplazmy komórki.

W naszych komórkach DNA stanowi magazyn informacji, a RNA pełni funkcję notatek z bieżącymi zadaniami. U koronawirusa magazynem informacji jest RNA, na którego podstawie tworzone są jego krótsze „wersje robocze”. Gdy komórka zaczyna je odczytywać i tworzyć wirusowe białka, blokują one produkcję jej własnych białek (żeby skupić wszelkie wysiłki na namnażaniu wirusa) oraz stymulują tworzenie m.in. białek wirusowego opakowania, do którego trafia skopiowane RNA wirusa. Gotowe winiony (cząsteczki wirusa) są wydzielane z komórki wraz z fragmentem jej błon lipidowych. Ale niektóre białka wirusa pojawiają się też na powierzchni zakażonej komórki, sczepiając i zlewając ją ze zdrowymi sąsiadami i tym samym rozprzestrzeniając zakażenie bez narażania się na odpowiedź układu odpornościowego.