Akcja denaturacja

Doświadczenie 1

Weź 3 jajka i bardzo dokładnie oddziel białka od żółtek – nawet śladowe ilości żółtka w białku negatywnie wpłyną na doświadczenie. Wykorzystując białka z dwóch jajek i odrobinę wody, usmaż jajecznicę na patelni. Trzecie białko przelej do wysokiego naczynia, dodaj 200 ml oleju i miksuj blenderem około minuty. Porównaj konsystencję jajecznicy i produktu blendowania w temperaturze pokojowej.

Wyjaśnienie: Tylko jakieś 10% białka jaja stanowią rzeczywiście białka, z których ponad połowa to owoalbuminy, białka rozpuszczalne w wodzie. Ich łańcuch polipeptydowy układa się w środowisku wodnym tak, że na zewnątrz eksponowane są reszty hydrofilowe (dążące ku wodzie). Z kolei reszty hydrofobowe (stroniące od wody) uciekają do środka, przy czym chętnie oddziałują ze sobą i spinają różne fragmenty łańcucha.

Silnie hydrofobowy olej odwraca sytuację – dotychczas ukryte reszty są wywijane na zewnątrz, a reszty hydrofilowe ukrywają się z dala od oleju. W efekcie zblendowana mikstura przypomina jednorodną jajecznicę, bardzo podobną do otrzymanej w wyniku obróbki termicznej (wysoka temperatura m.in. dodaje energii potrzebnej do zerwania oddziaływań spinających reszty aminokwasowe). Ubijanie piany z białek to także denaturacja – hydrofobowym środowiskiem jest powietrze, którego pęcherzyki zostają uwięzione w klatkach z wody i zdenaturowanych białek.

Doświadczenie 2

Dokładnie oddziel białka trzech jaj od żółtek. Białka przecedź przez sitko do osobnego naczynia – zbierz wyłącznie płyn, bez galaretowatych chalaz (sznury mocujące żółtko w jaju). Zajmie to kilka minut. Nie przecieraj białek na sitku i pilnuj, aby galaretowata substancja nie zaczęła przez nie przeciekać. Uzyskanym płynem napełnij dwa kieliszki do 1/4 wysokości. W pojemnikach na mocz dodaj do 10 ml wody: (A) pół łyżeczki granulek środka do udrożniania rur zawierającego NaOH albo (B) 10 ml spirytusu (ok. 96%) rozcieńczonego pół na pół z wodą. Roztworem A lub B dopełnij kieliszki z białkiem do połowy wysokości i intensywnie rozmieszaj plastikową łyżeczką. Porównaj wygląd płynów bezpośrednio po zmieszaniu, po 30 min i po 24 godz.

Wyjaśnienie: W typowej komórce pH wynosi ok. 7, nawet gdy otoczenie ma skrajnie odmienną kwasowość. Jest więc precyzyjnie regulowane, gdyż nawet niewielkie zmiany pH prowadzą do utraty aktywności kluczowych dla przeżycia komórki białek. Struktura białek jest stabilizowana m.in. dzięki wiązaniom wodorowym i mostkom solnym. Alkohol także może tworzyć wiązania wodorowe. Rozluźnia to i destabilizuje strukturę białek, które dodatkowo zlepiają się, tworząc ogromne agregaty, widoczne gołym okiem jako białe kłaczki. W obecności jonów (np. Na+ lub Cl–) dochodzi do zrywania mostków solnych, zwykle także stabilizujących strukturę białka. W środowisku zasadowym (pH 10) obserwujemy dodatkowo sieciowanie owoalbumin. Inicjuje je już 0,04 g NaOH w 10 ml płynu. Spiralnie zwinięte fragmenty pojedynczego białka rozwijają się wtedy do postaci nici. Mogą one następnie oddziaływać z podobnymi fragmentami cząsteczek pozostałych białek, tworząc gęste sieci, w których związana zostaje woda. Przemianę tę postrzegamy jako żelowanie – już w ciągu kilku minut konsystencja białka jaja zmienia się z płynnej w szybko tężejącą galaretę, a potem – gumowate ciało stałe. Będzie ona najtwardsza po 15– 30 min od rozpoczęcia reakcji, później stopniowo będzie się rozpuszczać.

Doświadczenie 3

W pojemniku na mocz w 20 ml wody rozpuść łyżeczkę granulek środka do udrożniania rur zawierającego NaOH. W kolejnym pojemniku do 10 ml tego roztworu dodaj 10 ml roztworu soli miedzi(II) – roztwór powinien być intensywnie zabarwiony. Sole miedzi uzyskasz np. poprzez długotrwałe gotowanie w emaliowanym garnku miedzianej mufki (do kupienia w sklepach z artykułami dla hydraulików) z 10-procentowym octem spirytusowym. Do mieszaniny dodaj strzykawką ok. 5 ml białka jaja kurzego, przygotowanego z użyciem sita jak w doświadczeniu 2. Zamieszaj plastikową łyżeczką i oceń barwę roztworu. Stopniowo, stale mieszając, dodawaj ocet. Gdy wytrącą się białe kłaczki, za pomocą strzykawki, powoli i intensywnie mieszając, dodawaj roztwór NaOH. Oceń barwę i konsystencję płynu.

Wyjaśnienie: Roztwory soli miedzi(II) przyjmują niebieską lub niebieskozieloną barwę. W obecności NaOH dochodzi do wytrącenia się galaretowatego, intensywnie niebieskiego osadu wodorotlenku miedzi(II) – Cu(OH)₂. W środowisku alkalicznym dochodzi do przegrupowania wiązań peptydowych (łączących reszty aminokwasowe białek), co umożliwia tworzenie z jonami miedzi związków kompleksowych o barwie fioletowej. Reakcja ta prowadzi do denaturacji. Dodany potem kwas octowy zobojętnia Cu(OH)₂ i w efekcie powstaje łatwo rozpuszczalny niebieskozielony octan miedzi. Kwaśne środowisko powoduje także rozpad kompleksów jonów miedzi i białka. Jednak obecność jonów miedzi działa jak czynnik denaturujący – zrywają one mostki solne i disiarczkowe. W efekcie tworzą się agregaty zdenaturowanych białek, które widać jako serowate kłaczki. Dodatek NaOH ponownie umożliwia tworzenie kompleksów jonów miedzi z wiązaniami peptydowymi. Zagarniając je dla siebie, „otaczają” one łańcuch warstewką utrudniającą agregację – białe kłaczki stopniowo się rozpuszczają.

dr hab. Renata Szymańska
Katedra Fizyki Medycznej i Biofizyki AGH

dr Paweł Jedynak
Zakład Fizjologii i Biochemii Roślin WBBiB UJ

***

Uwaga! Wykonując doświadczenia, zachowuj ostrożność. Niepełnoletni powinni wykonywać doświadczenia pod nadzorem dorosłych. Związki miedzi są toksyczne po spożyciu. NaOH jest żrące. Unikaj ich kontaktu ze skórą i oczami. Używaj okularów i rękawiczek ochronnych.

***

Zestaw przyrządów i materiałów

pojemniki na mocz, ocet 10%, spirytus 96%, miedziana mufka, 10 jaj, plastikowa łyżeczka, olej, środek do udrożniania rur zawierający NaOH, strzykawki poj. 5 ml

Niewliczone w cenę: blender, wysokie naczynie, patelnia, emaliowany garnek, kieliszki, okulary i rękawiczki ochronne

Czas przygotowania: 2 godz., obserwacji: 24 godz.

Koszt: 60 zł

***

Wiedza w pigułce

Każde białko to długi łańcuch połączonych ze sobą reszt aminokwasowych.

Dla procesów przebiegających w organizmie znaczenie ma odpowiednia konformacja białka, czyli ułożenie w trójwymiarowej przestrzeni reszt aminokwasów o określonych własnościach. Gdy weźmie się pod uwagę stopień skomplikowania struktury białek, może zaskakiwać, jak w ogóle uzyskują one prawidłową konformację. Tymczasem okazuje się, że jest ona stanem o najniższej energii, a jej uzyskiwanie to proces samorzutny. Podobnie zachowuje się gumka recepturka – nawet gdy ją skręcimy, powstałe naprężenia spowodują jej rozwinięcie i powrót do owalnego kształtu.

Reszty aminokwasowe białka przyciągają się lub odpychają, a usuwanie naprężeń i powstawanie wiązań między niektórymi resztami prowadzi do uzyskania prawidłowej formy. W komórce dodatkowo pomagają w tym białka opiekuńcze. Prawidłowa konformacja jest stabilna jedynie w określonych warunkach fizycznych i chemicznych. Zarówno zbyt wysoka, jak i zbyt niska temperatura mogą prowadzić do denaturacji, czyli nieprawidłowego splątania łańcucha całego lub tylko fragmentu białka. Nieodpowiednie pH sprzyja rozsunięciu określonych reszt kwasowych lub zasadowych – ich ładunek rozpycha zwykle zwarte struktury. W obrębie łańcucha niektóre reszty łączą się w pary słabymi oddziaływaniami, zbliżając odległe fragmenty do siebie. Wiązania te są rozrywane przez takie związki chemiczne jak sole, alkohol czy mocznik, co powoduje rozpad stabilnej struktury. Podczas denaturacji nie dochodzi jednak do przerwania łańcucha reszt aminokwasowych, zatem w niektórych sytuacjach po usunięciu czynnika denaturującego możliwe jest odzyskanie wyjściowej konformacji, czyli renaturacja (z łac. „odrodzenie”) białka.

***

Uwaga!

Redakcja nie ponosi odpowiedzialności za ewentualne szkody powstałe wskutek doświadczeń.