Z kalendarza: 25. rocznica urodzin sklonowanej owcy Dolly
Bakterie często kojarzą nam się z czymś niezbyt miłym, najczęściej chorobami i zatruciami pokarmowymi. Mało kto jednak wie, że ich przedstawicielka Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) przyczyniła się do farmaceutycznej i przemysłowej rewolucji. Dzięki modyfikacjom genetycznym można zaprogramować jej komórki do produkcji wielu substancji. Bakteria ta została odkryta w 1885 r. przez austriackiego lekarza Theodora Eschericha i stała się najlepiej opisanym i poznanym pod kątem reakcji biochemicznych organizmem na świecie. Co ciekawe, występuje naturalnie w przewodzie pokarmowym człowieka, gdzie pomaga w trawieniu pokarmu oraz syntetyzuje witaminy z grupy B i K. Niestety, gdy trafi do innych układów, np. moczowego, może wywoływać choroby.
Bakteryjne mikrofabryki
Metody inżynierii genetycznej pozwalają na wprowadzenie zmian w materiale genetycznym E. coli tak, by „nauczyć” ją produkcji ludzkiej insuliny. Robi się tak już od lat 90. ub.w. Najpierw należy przetłumaczyć ludzki gen na język zrozumiały dla bakterii. Geny w naszym DNA składają się z części kodujących i niekodujących, natomiast bakteryjna informacja genetyczna jest zapisana językiem prostszym – bez elementów niekodujących. Dlatego trzeba wyciąć je z ludzkiego genu insuliny. Taki sztuczny gen przenosi się następnie do komórek baterii pod postacią plazmidu (fot. na s. 20). Bakterie są hodowane w dużych zbiornikach, a komputer gwarantuje utrzymanie stałego składu pożywki hodowlanej, poziomu temperatury, ilości tlenu oraz szeregu innych parametrów. Aby pozyskać białko z bakterii, ich zawartość zostaje poddana oczyszczeniu, a potem działaniu enzymów. Gotowy produkt trafia na półki apteczne, by przyjść z pomocą pacjentom cierpiącym na cukrzycę.
Tak wyglądały początki biologii syntetycznej. Naukowcy dostrzegli olbrzymi potencjał leżący w manipulacji zapisaną w DNA informacją genetyczną. Kolejne odkrycia krok po kroku przybliżały ich do kreacji sztucznego życia i stworzenia komórki produkującej białka na życzenie.
Narodziny sztucznej komórki
Craig Venter to rewolucjonista i wizjoner, a do tego najsłynniejszy obecnie genetyk na świecie. Ten geniusz o nieprzeciętnym IQ 142 oprócz zachwytu wzbudza jednak także kontrowersje. Dzięki komercjalizacji swoich badań stał się milionerem – założył kilka firm biotechnologicznych stosujących odkryte przez niego metody odczytywania i modyfikacji DNA. Jego majątek szacuje się obecnie na 300 mln dol. To on pierwszy odczytał genom żywego organizmu (bakterii Haemophilus influenzae), dzięki czemu określił minimalną liczbę genów potrzebnych komórce do przeżycia, a ten „przepis” wykorzystał później do stworzenia sztucznego DNA. Venter brał także udział w olbrzymim projekcie odszyfrowania genomu człowieka (Human Genome Project). Prawdziwą sławę przyniosło mu jednak stworzenie syntetycznej komórki.
Postawienie pierwszego kroku na drodze do wykreowania sztucznego życia zajęło naukowcom aż 15 lat. Komórka w pełni kontrolowana przez sztuczne DNA powstała dzięki syntezie mniejszych odcinków DNA bakterii Mycoplasma mycoides, które następnie połączono i wprowadzono do pozbawionej DNA innej komórki bakteryjnej Mycoplasma capricolum. Składała się ona jedynie z błony komórkowej i cytoplazmy (zawierającej potrzebne do funkcjonowania i syntezy białek organelle). Po takim zabiegu komórki mogły się dzielić. W ten sposób powstała zupełnie nowa komórka o cechach M. mycoides. Syntetyczne DNA przejęło kontrolę nad „pustą” komórką, przekształcając ją w nowy gatunek mikroba.
Szacuje się, że w ciągu ostatnich 25 lat szybkość odczytywania sekwencji DNA wzrosła 100 mln razy! Pierwsze sekwencjonowanie DNA Haemophilus influenzae zajęło badaczom dwa miesiące. Wykonanie tej samej procedury dziś trwałoby zaledwie dwa dni. Co ważne, wciąż o wiele łatwiej jest odczytać sekwencję DNA niż stworzyć ją od nowa. Fragmenty DNA, szczególnie te dłuższe, bardzo ciężko odtworzyć w laboratorium. Na tym właśnie polegał fenomen odkrycia Ventera. Znalazł sposób na to, jak posklejać krótkie łańcuchy syntetycznego DNA, by powstał kompletny genom. Najpierw badacze zaprojektowali tzw. kasety z nie za długiego DNA. Powstało ich około setki. Następnie odcinki te połączono w odpowiedniej kolejności, a każdy z powstałych fragmentów został powielony w komórce bakterii.
Niestety, mikroorganizmy, których naukowcy użyli jako powielaczy sekwencji DNA, nie były w stanie przepisać kodu zawierającego więcej niż 200 tys. „cegiełek” (par zasad). Wydawało się, że cały eksperyment spalił na panewce. Wtedy z pomocą przyszły drożdże. Dysponują one enzymami, które doskonale sklejają ze sobą nawet bardzo długie fragmenty DNA. Kompletny sztuczny genom mycoplazmy wprowadzono następnie do komórek Mycoplasma capricolum. Pierwsze próby okazały się niezadowalające. Komórki nie wykazywały funkcji życiowych. Zaczęto więc mozolnie przeszukiwać syntetyczne DNA, literka po literce, aby zlokalizować krytyczny błąd. Po miesiącach żmudnej pracy wreszcie się udało. Błędy zostały naprawione, a na jednej z szalek wyrosła kolonia bakteryjna sterowana sztucznym DNA. Komórki „ożyły”. Nowy szczep bakterii pieszczotliwie nazwano Synthia 1.0.
Sztuczna bakteria Synthia 1.0 z 901 genami posłużyła potem do skonstruowania najmniejszego organizmu na świecie – Syn 3.0, mającego jedynie 473 geny. To prawdziwy mistrz wagi lekkiej! Na świecie nie istnieje organizm z mniejszą liczbą genów. Na przykład człowiek posiada ich 20–25 tys., E. coli – 4,5 tys., a Mycoplasma genitalium, dotychczasowy rekordzista, tylko 525. Całe sekwencje Synthia 1.0 lub tylko ich fragmenty wycinano i sprawdzano, czy organizm z tak zmienionym DNA będzie w stanie przeżyć. Przetestowano setki kombinacji, zanim się udało.
Sztuczny rybosom
Kolejnym pionierem biologii syntetycznej jest genetyk z Harvard University George Church. Podobnie jak Venter Church w swojej pracy badawczej skupia się na wynalezieniu technologii syntezy i odczytywania DNA. Dzięki ich zastosowaniu ma nadzieję na poprawienie dzieła stworzenia.
Rybosomy występują w komórkach wszystkich organizmów żywych – bakterii, grzybów, roślin oraz zwierząt. Są to mikroskopijne fabryki białek, których głównym zadaniem jest przetłumaczenie zapisanego w DNA kodu na sekwencję aminokwasów budujących białko. W toku ewolucji struktura rybosomów ulega jedynie minimalnym zmianom, dlatego ich budowa jest podobna nawet u daleko spokrewnionych organizmów. Każdy rybosom składa się z dwóch podjednostek: dużej i małej, zbudowanych z białek i rRNA.
W swoim eksperymencie Church wyizolował rybosomy ze wspomnianej wcześniej E. coli i rozłożył je na kawałki, otrzymując białka i cząsteczki rRNA. Potem, używając syntetycznego rRNA, odtworzył strukturę rybosomu. Nowe rybosomy cechowały się pełną funkcjonalnością – wytworzyły lucyferazę, białko umożliwiające bioluminescencję (emisję światła), występujące naturalnie u robaczka świętojańskiego. Dzięki opanowaniu technologii budowania rybosomów będzie można wytwarzać w laboratorium związki, których synteza jest bardzo kosztowna. Obecnie białka produkuje się najczęściej w E. coli, lecz proces ten nie należy do najwydajniejszych. Church uważa, że synteza jedynie z udziałem rybosomu okaże się o wiele bardziej opłacalna. Przede wszystkim jednak stworzenie sztucznego rybosomu to krok milowy na drodze do w pełni sztucznego życia.
Zredefiniować naturę
Zapis informacji genetycznej w DNA opiera się na czterech nukleotydach (skróty ich nazw to A, T, C i G), takich samych u wszystkich organizmów żywych – zwierząt, roślin, bakterii, a nawet wirusów. Najnowsze badania próbują oszukać miliony lat ewolucji i rozszerzyć zapis informacji genetycznej. Dzięki opracowanej przez badaczy technologii można stworzyć zupełnie nowy rodzaj syntetycznych organizmów.
Naukowcy ze Scripps Research Institute w Kalifornii do czterech podstawowych nukleotydów dodali dwa nowe – d5SICS i dNaM – które nazwali odpowiednio X oraz Y. Do eksperymentów wykorzystano dobrze znane bakterie E. coli. To do ich genomu wprowadzono nowe znaki. Pierwsze próby zaczęły się w 2014 r., ale okazały się niesatysfakcjonujące – organizmy się nie namnażały. Wreszcie element Y został tak zmodyfikowany, aby pewien ważny w czasie podziału komórki enzym precyzyjnie go rozpoznawał. Użyto też specjalnego związku, który wspomagał transport nukleotydów przez błonę komórek. W ten sposób powstały zmodyfikowane bakterie E. coli, których DNA składało się nie z czterech, ale z sześciu elementów! Opracowana przez badaczy technika to prawdziwy przełom w biologii syntetycznej. Pozwala tworzyć unikatowe organizmy o cechach niespotykanych naturalnie w przyrodzie. Naukowcy uważają, że mogą one zredefiniować biologię.
W organizmach żywych na podstawie DNA aminokwasy (około 20) łączą się w łańcuchy budujące białka. Prawdziwym wyzwaniem dla badaczy było sprawienie, aby DNA z dodatkowymi nukleotydami X i Y mogło być wykorzystane tak jak naturalne do produkcji białek. Okazało się, że półsyntetyczne komórki E. coli nie tylko odczytują i tłumaczą sztuczne DNA, ale także na jego bazie wytwarzają białka. Co więcej, białka te składają się z dodatkowych nienaturalnych 152 aminokwasów! Organizm ze sztucznym DNA potrafi się namnażać – syntetyczne zasady są stwierdzane w materiale genetycznym nawet po 60 podziałach.
Taki mały kosmita może budzić strach. Naukowcy zadbali jednak o to, by był całkowicie bezpieczny. Nie namnoży się poza laboratorium, bo w naturze nukleotydy X i Y nie występują. To niesamowite odkrycie może za to przyczynić się do produkcji zupełnie nowych białek oraz leków, a także organizmów o niebywałych i niespotykanych obecnie cechach.
Jak wskrzesić mamuta?
Mamuty włochate wymarły podczas ostatniej epoki lodowcowej, ok. 4 tys. lat temu. Niestety naukowcy ciągle nie potrafią odpowiedzieć na pytanie, dlaczego zniknęły z powierzchni Ziemi. Sugeruje się, że odpowiedzialne za to były zmiany klimatyczne, choroba zakaźna lub działalność człowieka. Należały one bowiem do ulubionej zwierzyny łownej ludzi – dostarczały nie tylko pożywienia, ale też materiału do wyrobu narzędzi i okryć wierzchnich.
Zespół ambitnych naukowców z Harvard University, kierowany przez George’a Churcha, obiecuje, że przywróci do życia ten wymarły gatunek w ciągu dwóch lat. Odnalezione na Syberii szczątki mamutów stały się źródłem DNA, które następnie odczytano litera po literce. Okazało się, że najbliższym żyjącym obecnie krewnym włochatego olbrzyma jest słoń azjatycki. Oba gatunki różnią się budową 1642 genów. Naukowcy planują jednak stworzenie hybrydy dzięki zastąpieniu tych genów w DNA słonia ich mamucim odpowiednikiem. Wszystko to będzie możliwe dzięki okryciu technologii CRISPR, umożliwiającej precyzyjne manipulacje w genomie. Już teraz naukowcom udało się wprowadzić 45 genów mamuta do DNA słonia. To one warunkują rozwój najbardziej charakterystycznych dla mamutów cech, takich jak małe uszy, bujne futro, obfita tkanka tłuszczowa nagromadzona pod skórą czy specyficzna hemoglobina transportująca tlen nawet w ekstremalnie niskich temperaturach. Kiedy sekwencja DNA będzie już w pełni gotowa, badacze przystąpią do kolejnego etapu – klonowania. Połączony materiał genetyczny słonia i mamuta trzeba będzie wprowadzić do zapłodnionej komórki jajowej słonia. Przy wykorzystaniu analogicznej metody w 1996 r. sklonowano słynną owieczkę Dolly. Ponieważ procedura pobierania komórek jajowych nie należy do najprostszych, tym razem naukowcy zmodyfikują tę technikę. Ze względu na zagrożenie wyginięciem słoni azjatyckich pobiorą od nich nie komórki jajowe, lecz komórki skóry, które w warunkach laboratoryjnych tak przeprogramują, by dały początek komórce jajowej. Choć brzmi to jak prawdziwa alchemia, otrzymane w ten sposób komórki zostaną zapłodnione, a obecny w nich materiał genetyczny zostanie zastąpiony hybrydowym, mamucio-słoniowym DNA. Kolejnym etapem klonowania byłoby wszczepienie takiego embrionu do macicy matki zastępczej, w tym wypadku samicy słonia azjatyckiego. I tu również badacze w trosce o gatunek zamierzają nieco zmodyfikować procedurę. Zarodek hybrydy będzie rozwijał się w sztucznej macicy. Już teraz udało się w ten sposób hodować przez 10 dni zarodki mysie (pełna ciąża u myszy trwa 20 dni).
Wykorzystując podobną metodę, w 2003 r. próbowano w Hiszpanii przywrócić do życia wymarły gatunek koziorożca – Capra pyrenaica. Niestety, zwierzę żyło po porodzie jedynie kilka minut. W związku z planowanymi eksperymentami pojawiają się pytania kwestionujące ich zasadność. Czy w razie udanych prób jesteśmy w stanie zagwarantować tym zwierzętom naturalny habitat? Obecnie rejony azjatyckiej tundry zagrożone są dewastacją. Najnowsze osiągnięcia inżynierii genetycznej to szansa dla gatunków zagrożonych wyginięciem, ale też wielka odpowiedzialność dla ludzi. Szacuje się, że każdego dnia z powierzchni Ziemi znika ok. 150 gatunków. To tysiąc razy więcej niż przed pojawieniem się na niej człowieka.
Katarzyna Kornicka
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Katedra Biologii Eksperymentalnej